درک ده ها هزار پروتئینی که پروتئوم انسانی را تشکیل می دهند به عنوان یک چالش کلیدی در این قرن ظاهر شده است، و تلاش های تحقیقاتی تا به امروز پیشرفت های عمده ای را در کشف دارو و درک زیست شناسی پایه ممکن کرده است. اما بسیاری از راه های بالقوه به دلیل کمبود اطلاعات در مورد نحوه عملکرد اکثر این پروتئین ها مسدود شده اند.
بخش عمده ای از این پروتئین های مرموز تاکنون ممکن است به لطف تحقیقات تیمی در موسسه تحقیقاتی اسکریپس و مرکز غربالگری مولکولی آن، اکنون قابل مطالعه باشد.
دانشمندان اولین تکنیک غربالگری با توان عملیاتی بالا را توسعه داده اند که حتی با پروتئین هایی که اطلاعات کمی در مورد آنها وجود دارد کار می کند و جستجو برای مولکول هایی که این پروتئین ها با آنها تعامل دارند و بازدارنده هایی که ممکن است فعالیت پروتئین ها را مسدود کنند را امکان پذیر می کند.. در حال حاضر، روش جدید، که در نسخه 29 مارس 2009 مجله Nature Biotechnology توضیح داده شده است، به تیم اجازه داده است تا مهارکننده های دو آنزیم را که تصور می شود نقش مهمی در پیشرفت سرطان دارند، شناسایی کنند.
بیشتر مطالعات روی آنزیم ها بر سنجش سوبسترا تکیه دارند، که به محققان اجازه می دهد تا فعالیت آنزیم ها را به وضوح دنبال کنند. کار با سوبستراها برای درک بهتر عملکرد سلولی و شناسایی مولکول‌هایی که از فعالیت آنزیم‌هایی که نقش حیاتی در بیماری‌هایی مانند سرطان ایفا می‌کنند و پیشبرد درمان‌های دارویی بالقوه مهار می‌کنند، بسیار مهم است.
با این حال، یکی از موانع اصلی در تحقیقات پروتئینی این است که توسعه سنجش های سوبسترای مرسوم و ابزارهای مرتبط نیازمند دانش مولکول هایی است که پروتئین معین با آن ها متصل می شود. اما چنین اطلاعاتی فقط برای یک سوم پروتئوم موجود است.
بن کراوات، رئیس بخش فیزیولوژی شیمی در تحقیقات اسکریپس و نویسنده مسئول مطالعه جدید، می‌گوید: «دو سوم یا بیشتر از این پروتئین‌ها تا حد زیادی کاملاً مشخص نیستند. چالش های بزرگ."
برای پیشبرد تحقیقات پروتئومیک، تیم کراوات چندین سال پیش تکنیکی را توسعه دادند که اکنون به طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد به نام پروفایل پروتئین مبتنی بر فعالیت (ABPP). تغییرات زیادی وجود دارد، اما فرض اصلی ABPP توسعه پروب هایی است که به پروتئین ها متصل می شوند، حتی زمانی که اهداف، یا بسترهای آنها شناخته شده نیست، به عنوان مثال با بهره برداری از عناصر ساختاری یا مکانیکی که توسط طیف وسیعی از پروتئین ها در یک کلاس خاص استفاده می شود. این به دانشمندان اجازه می‌دهد تا کاوشگرهایی با طیف وسیع بسازند که با مجموعه‌ای از پروتئین‌های نامشخص کار می‌کنند و تجزیه و تحلیل عملکردی آنها را پیش می‌برند.
در حالی که ABPP واقعاً کار با پروتئین های نامشخص را ممکن کرده است، یک اشکال عمده این است که این تکنیک به تجزیه و تحلیل ژل یا طیف سنجی جرمی پر زحمت برای تعیین نتایج یک آزمایش معین، مانند صفحه نمایش یک کتابخانه خاص از ترکیبات نیاز دارد. فعالیت بازدارندهچنین تکنیک‌های بازخوانی خود را به اتوماسیون سریع نمی‌دهند، و برنامه‌های غربالگری را به کتابخانه‌های تنها چند صد مولکول محدود می‌کنند. با توجه به اینکه اکنون محققان دانشگاهی و شرکتی به طور یکسان به غربالگری صدها هزار مولکول برای دستیابی به بسیاری از اهداف خود متکی هستند، این یک محدودیت جدی است.
گام بزرگ رو به جلو
اکنون، با ترکیب ABPP برای اولین بار با یکی دیگر از روش‌های تشخیص با توان بالا از مرکز غربالگری مولکولی تحقیقاتی اسکریپس، یک مرکز ملی با بودجه نقشه راه مؤسسه ملی سلامت (NIH) برای کشف مولکول‌های کوچک در مشتری، پردیس های فلوریدا و لا جولا، کالیفرنیا، تیم کراوات این محدودیت را حذف کرده است. این روش جدید بر همان کاوشگرهای طیف گسترده ای است که قبلا برای ABPP استفاده می شد، اما به جای تکنیک های ژل، تیم نشان داده است که می تواند به سرعت نتایج تجربی را با استفاده از تکنیکی به نام پلاریزاسیون فلورسانس بخواند.
مولکول های فلورسنت وقتی با نور یک رنگ برخورد می کنند برانگیخته می شوند و باعث می شوند نوری با رنگ متفاوت دوباره ساطع کنند. درجه قطبی شدن آن نور، به عبارت دیگر میزان همسویی آن امواج نور فلورسنت ساطع شده تا حد زیادی با بزرگی مولکول فلورسنت تعیین می شود. مولکول‌های کوچک‌تر با سرعت بیشتری می‌چرخند و باعث می‌شوند که نور ساطع شده‌شان قطبی‌تر شود، بنابراین نور مولکول‌های بزرگ‌تر به‌طور قابل‌توجهی قطبی‌تر می‌شود.
کاوشگرهای فلورسنت مورد استفاده برای برچسب زدن پروتئین ها معمولاً بسیار کوچک هستند، بنابراین فلورسانس آنها خیلی قطبی نیست. اما، هنگامی که یک کاوشگر به یک پروتئین متصل می شود، آنها با هم مولکول بسیار بزرگتری می سازند، که به طور قابل توجهی قطبش را افزایش می دهد و باعث می شود که مقادیر قطبش فلورسانس بالا برود.
اگر یک مهارکننده به طور موثر با یک پروتئین خاص متصل شود، می تواند از یک پروب سبقت بگیرد و افزایش قطبش فلورسانس اندازه گیری شده را کند یا از بین ببرد. در نتیجه، پلاریزاسیون فلورسانس معیاری سریع و آسان برای مهار موفقیت آمیز ارائه می دهد، و نیازی به جداسازی یا مراحل شستشو ندارد، بنابراین این تکنیک به راحتی در یک سیستم غربالگری خودکار با توان عملیاتی بالا گنجانده می شود.
هنگامی که مهارکننده‌های مؤثر از طریق تکنیک جدید به نام fluopol-ABPP شناسایی شدند، تیم Cravatt سپس به روش‌های تثبیت‌شده ABPP بازمی‌گردند، به عنوان مثال برای مطالعه رفتار مهارکننده‌های بالقوه جالب در داخل سلول‌ها و بافت‌ها برای تعیین تعیین می‌کنند. که در اتصال انتخابی با آنزیم مورد نظر مؤثرترین هستند.
برای نشان دادن پتانسیل fluopol-ABPP، تیم از آن برای مطالعه دو آنزیم از طبقات کاملاً متفاوت استفاده کرد. اولین آنزیم رتینوبلاستوم باندینگ پروتئین 9 یا RBBP9 نام دارد. این موضوع مخصوصاً مناسبی بود زیرا، در حالی که RBBP9 سال ها پیش کشف شد و به نظر می رسد نقش مهمی در برخی سرطان ها ایفا می کند، محققان هیچ پیشرفتی در ایجاد تمرکز بر فعالیت بیولوژیکی RBBP9 نداشته اند.
کراوات می‌گوید: «این یک مثال عالی از این است که گاهی اوقات، حتی با یک آنزیم کوچک و ساده، شناسایی هر نوع سوبسترا چقدر چالش برانگیز است، و اگر نمی‌دانید بستر چیست. ، شما اساساً خوش شانس نیستید."
حداقل این مورد در گذشته بوده است.
نتایج غیرمنتظره
با این حال، تیم با استفاده از fluopol-ABPP، نزدیک به 19000 ترکیب مختلف را در جستجوی ترکیباتی که ممکن است RBBP9 را مهار کنند، غربالگری کردند. آنها حدود 20 ترکیب بازدارنده را شناسایی کردند که به طور مؤثری با آنزیم پیوند می‌خوردند، و سپس مطالعات بیشتر ABPP نشان داد که یک ترکیب، آلکالوئیدی به نام امتین، به ویژه مؤثر است. امتین یک محصول طبیعی است که از ریشه گیاه ipecacuanha به دست می آید. مشخص بود که این ماده دارای خواص کشنده سرطان یا سیتوتوکسیک است، اما مکانیسم آن نامشخص باقی مانده است.
کراوات می‌گوید: «ما هیچ سرنخی نداشتیم که emetine بتواند برچسب‌گذاری پروب RBBP9 را تا زمانی که صفحه نمایش را انجام نداده‌ایم مسدود کند.»
اکنون این گروه می تواند این احتمال را که سمیت سلولی امتین ممکن است شامل فعالیت علیه RBBP9 باشد را بررسی کند، و درک بهتر این تعامل اتصال باید درک ما را از بسترهایی که ممکن است آنزیم در سلول های طبیعی و سرطانی به آنها متصل شود، بیشتر کند..
گروه موفقیت مشابهی در کار با آنزیمی از کلاس مکانیکی متفاوت به نام گلوتاتیون S-ترانسفراز امگا 1 (GSTO1)، یک آنزیم اکسیدوردوکتاز داشتند. آنزیم‌های این دسته به‌عنوان اهداف بالقوه داروهای ضد سرطان مورد توجه قرار گرفته‌اند، زیرا در سلول‌های سرطانی تهاجمی متمرکز شده‌اند که به شیمی‌درمانی مقاوم هستند. با این حال، مانند RBBP9، اطلاعات بسیار کمی در مورد فعالیت GSTO1 وجود داشت.
به دنبال همان طرح آزمایشی پایه، اما با استفاده از یک کاوشگر فلورسنت متفاوت، تیم کراوات حدود 2000 مولکول مختلف را غربالگری کردند و چندین مولکول را شناسایی کردند که به شدت GSTO1 را مهار می کنند.
گروه از نتایج این آزمایش‌های اولیه fluopol-ABPP برای هدایت تحقیقات آینده در مورد نقش آنزیم‌ها در سرطان، پتانسیل مهارکننده‌های شناسایی شده به عنوان داروهای ضد سرطان و نقش گسترده‌تر آنزیم‌ها استفاده خواهد کرد.
موفقیت هر دو آزمایش شواهدی از پتانسیل fluopol-ABPP ارائه می دهد. کراوات می‌گوید: «این قطعاً در بین طبقات و برای بسیاری از آنزیم‌های یک کلاس قابل حمل است، بنابراین دامنه استفاده را افزایش می‌دهد.»
تیم در حال حاضر ده‌ها کاوشگر با طیف وسیع برای کلاس‌های مختلف پروتئین ایجاد کرده‌اند، که راه‌های بالقوه بی‌شماری را برای کار آینده هم برای گروه کراوات و هم برای سایرین باز می‌کند.
در مقیاسی کلی تر، این روش جدید باید محققان را قادر سازد تا شروع به درک نقش ها و فعالیت های آن دو سوم از پروتئین های مرموز انسانی کنند که مشخص نشده است. کراوات می‌گوید: «من فکر می‌کنم داشتن ابزارهایی مانند fluopol-ABPP می‌تواند یک جهش بزرگ در آغاز مشخص کردن این بخش از پروتئوم باشد.»
علاوه بر کراوات، سایر نویسندگان مقاله، با عنوان "شناسایی بازدارنده های انتخابی آنزیم های نامشخص با غربالگری با کارایی بالا با پروب های مبتنی بر فعالیت فلورسنت"، دانیل باچوچین، استیون براون و هیو روزن هستند. از موسسه تحقیقاتی اسکریپس.
