مدار ژن مصنوعی اجازه دوز دقیق بیان ژن را می دهد

محققان یک مدار ژنی ساخته اند که امکان تنظیم دقیق بیان ژن در سلول را فراهم می کند، پیشرفتی که باید امکان تجزیه و تحلیل دقیق تر نقش ژن در عملکرد طبیعی و غیر طبیعی سلولی را فراهم کند.

این "اثر دوز" ژن با نصب یک حلقه بازخورد منفی در مدار ژن مصنوعی به دست می آید، مفهومی شبیه به کنترل اعوجاج سیگنال در الکترونیک، تیمی به سرپرستی دانشمندان مرکز سرطان دانشگاه تگزاس M. D. Anderson گزارش می دهد. این هفته در نسخه اولیه آنلاین مجموعه مقالات آکادمی ملی علوم.

"برای درک اینکه یک ژن چه کاری انجام می دهد، باید بیان آن را تغییر دهید و نتایج را مشاهده کنید. روش های فعلی اجازه کنترل دقیق بیان ژن را نمی دهند." دپارتمان زیست شناسی سیستمی M. D. Anderson.

حذف ژن ها یک رویکرد همه یا هیچ است و سرکوب آنها با RNA مداخله گر کوچک اثرات نامطلوبی دارد. بالازی خاطرنشان کرد: ترانسفکشن سلول ها با ناقل بیان ژن، ژن را بیش از حد بیان می کند، اما همچنان به روشی کنترل نشده. سیستم بیان ژن مصنوعی که محققان در یک مدل مخمر ایجاد کردند، امکان بررسی دقیق‌تر اثرات یک ژن را فراهم می‌کند.

بالازی گفت: "بگویید شما ژنی دارید که در مقاومت به داروها نقش دارد و می خواهید بدانید سلول در سطوح مختلف بیان چقدر محافظت می کند." "شما مدار ژن را در ابتدا در سلول ها قرار می دهید تا به طور کامل ژن محافظ را سرکوب کنید.سپس بیان ژن را به سطح مورد نظر تنظیم می کنید و شیمی درمانی را به کشت سلول اضافه می کنید تا رابطه بین ژن و دفاع سلولی در برابر دارو را کشف کنید.»

مدار بیان ژن ساخته شده توسط Balázsi و همکارانش یک رابطه خطی بین دوز یک القایی که مدار را تنظیم می کند و سطح بیان ژن ایجاد می کند.

شبکه ژن ساخته شده برای سرکوب

تیم ابتدا یک شبکه ژنی را ساختند که برای سرکوب yEGFP، یک ژن گزارشگر فلورسنت طراحی شده بود که حضور آن در هر سلول در یک کشت با فلوسیتومتری قابل تشخیص است. مدار ژن سپس به محیط رشد اضافه شد، جایی که در سلول ها پخش شد و در DNA مخمر ترکیب شد.

مدار ژن با یک پروموتر شروع می شود که ژن سرکوبگر تتراسایکلین را راه اندازی می کند، که سپسرا مسدود می کند.

yEGFP از طریق یک پروموتر برای آن ژن، که بیان آن را خاموش می کند. افزودن انیدروتتراسایکلین (ATc) به کشت سلولی در دوزهای اندازه‌گیری شده، سرکوبگر تتراسایکلین را خفه می‌کند و به بیان yEGFP اجازه می‌دهد.

وقتی ATc به کشت اضافه شد، در دوزهای پایین پاسخ کم یا بدون پاسخ وجود داشت، سپس یک افزایش ناگهانی و شدید در yEGFP، که به سرعت در حالت اشباع به یک فلات رسید. بالازی گفت: «این پاسخ سیگموئیدی نامیده می‌شود که به صورت خطی از دوز ATc پیروی نمی‌کند.»

مشابه اعوجاج و تقویت کننده

تیم سپس پروموتر را برای سرکوب کننده مشابه آنچه برای yEGFP استفاده می شود ساخت. این، در واقع، سرکوبگر تتراسایکلین را به خودش برمی‌گرداند، یک حلقه بازخورد منفی که منجر به کاهش خودکار رپرسور زمانی که به سطوح بالا می‌رسد و افزایش زمانی که سطوح کاهش می‌یابد، افزایش می‌یابد.

آنها دریافتند که افزودن خودتنظیمی منفی باعث می شود yEGFP به صورت خطی به دوز ATc پاسخ دهد. بنابراین یک افزایش 20 درصدی در ATc باعث افزایش 20 درصدی در بیان ژن می شود و به همین ترتیب.

Balázsi این را با برخورد با اعوجاج در مدارهای الکترونیکی مقایسه می کند. تقویت‌کننده‌ها سیگنال را تقویت می‌کنند، اما آن را مخدوش می‌کنند.با اعوجاج سیگنال قبل از ورود آن به تقویت کننده به روشی مخالف که تقویت کننده آن را تحریف می کند، این دو اعوجاج یکدیگر را خنثی می کنند و در نتیجه سیگنال واضحی ایجاد می شود. یکسان کردن هر دو پروموتور ژن تأثیر یکسانی در شبکه ژنی دارد.

این رابطه دوز-پاسخ خطی در حالی کار می کند که به سطوح بیان مشابهی از yEGFP در تمام سلول های کشت دست می یابد. تفاوت‌های سلول به سلول در کشت‌های سلولی تحت درمان با مدار ژنی که فاقد بازخورد منفی است، بسیار زیاد است، برخی از سلول‌ها مقدار زیادی yEGFP و برخی دیگر بسیار کم بیان می‌کنند. حلقه بازخورد تفاوت‌های سلول به سلول را یکسان کرد و همه آنها را به یکباره تحت تأثیر قرار داد و اثر دوز را بهبود بخشید.

پس از اولین آزمایش‌های خود با مدار ژن مصنوعی، محققان یک مدل ریاضی برای پیش‌بینی پاسخ بیان ژن در حضور خودتنظیمی منفی ساختند. مدار با تنظیم خودکار منفی طبق پیش‌بینی مدل انجام شد.

Balázsi گفت که تیم در حال کار بر روی یک مدار ژنی است که در مدل سلولی پستانداران نیز کار خواهد کرد. بالازی و همکارانش توالی‌ها یا مدارهای ژنی جدیدی ایجاد می‌کنند، بخشی از حوزه نوظهور زیست‌شناسی مصنوعی - کاربرد اصول مهندسی برای طراحی و ساخت قطعات و دستگاه‌های بیولوژیکی جدید

این تحقیق توسط بودجه راه‌اندازی M. D. Anderson برای محققین جدید به Balázsi و کمک‌های مالی از بنیاد ملی علوم و برنامه تحقیقات پیشرفته تگزاس/برنامه فناوری پیشرفته به یکی از نویسندگان Krešimir Josic، Ph. D. از گروه ریاضیات دانشگاه هیوستون.

نویسندگان مشترک با بالازی و جوسیچ عبارتند از دمیتری نووژای، M. D.، Ph. D.، و Rhys Adams، هر دو از گروه زیست شناسی سیستمی M. D. Anderson. آدامز همچنین دانشجوی کارشناسی ارشد در دانشکده علوم زیست پزشکی دانشگاه تگزاس است که به طور مشترک توسط M. D. Anderson و مرکز علوم بهداشت دانشگاه تگزاس در هیوستون اداره می شود. و کوین مورفی، دکتر. D.، از گروه مهندسی بیومدیکال دانشگاه بوستون، مرکز بیودینامیک و مرکز بیوتکنولوژی پیشرفته.